团体标准 | 医用清洗剂卫生要求 T/WSJD 002-2019

医用清洗剂卫生要求

Hygienic requirements for medical detergents

前   言

1   范围

2   规范性引用文件

3   术语和定义

4   原料要求

5   基本要求

6   技术要求

7   检验方法

8   运输、贮存和包装

9   标识要求

10   注意事项

附录A (规范性附录)   医用清洗剂对金属腐蚀性的测定

附录B (规范性附录)   酶活力的试验方法

附录C (规范性附录)   医用清洗剂对血液和细菌混合物的去除效果测试方法

附录D (规范性附录)   医用清洗剂对人工模拟污染物去除效果评价方法

附录E (规范性附录)   医用清洗剂对脂肪、蛋白质和淀粉的去除效果评价方法

附录F (规范性附录)   生物膜去除效果测定方法

本标准由中国卫生监督协会团体标准委员会提出并归口。

本标准由中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、北京协和医院、北京北亚骨科医院、湖北省疾病预防控制中心、北京大学深圳医院、楷腾医疗设备(中国)有限公司、3M中国有限公司、杭州鲁沃夫货物进出口有限公司、北京创新世纪生化科技发展有限公司、深圳市芭格美生物科技有限公司、上海九誉生物科技有限公司、北京佳士力科技有限公司、山东消博士消毒科技股份有限公司和南京万福金安生物医药科技有限公司起草。

本标准主要起草人:张流波、李涛、朱亭亭、邱侠、张青、李爱琼、黄小波、王继梅、陶威、刘芝兰、史绍毅、王志、郭宏涛、任银萍、周祺、王金强、蒋士龙。

1   范围

本标准规定了医用清洗剂原料要求、基本要求、技术要求、检验方法、运输、贮存和包装、标识要求及注意事项。

本标准适用于医用清洗剂的生产与应用。

2   规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 65   开槽圆柱头螺钉

GB/T 601   化学试剂标准滴定溶液的制备

GB/T 603   化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/T 679   化学试剂乙醇(95%)

GB/T 700   碳素结构钢

GB/T 1173   铸造铝合金

GB/T 1220   不锈钢棒

GB/T 2059   铜及铜合金带材

GB/T 2481.1   固结磨具用磨料粒度组成的检测和标记

GB/T 5750.4   生活饮用水标准检验方法感官性状和物理指标

GB/T 9721   化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)

GB9985   手洗餐具用洗涤剂

GB/T 15818   表面活性剂生物降解度试验方法

JB/T 7901   金属材料实验室均匀腐蚀全浸试验方法

ISO 15883   清洗消毒器

《消毒技术规范》(2002年版)卫生部

3   术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

用于增强水对医疗器械、器具及其他相关物品上污物清洗效果的制剂。

3.2

pH 值≤6.5的医用清洗剂。

3.3

pH 值在 6.5~7.5之间的医用清洗剂。

3.4

pH值≥7.5的医用清洗剂。

3.5

加入了酶制剂如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，能分解相应有机污染物的医用清洗剂。

3.6

具有专门用途，如抗抑菌、去除生物膜、除垢除锈等作用的医用清洗剂。

4   原料要求

4.1   表面活性剂:应为无毒或低毒级物质。

4.2   酶:其质量应符合企业标准要求。

4.3   抗菌剂:不得使用抗菌药物及其同名原料，不得使用各种醛类化合物。

4.4   水:在25℃条件下，电导率≤15μ S/cm。

5.1   医用清洗剂应使用安全，可有效去除相应的污染物。

5.2   医用清洗剂应符合下列要求:

6   技术要求

6.1感官

6.2杂质限量

6.3 金属腐蚀性

6.4硬度

6.5发泡

6.6稳定性

6.6.1物理性状稳定性

6.6.2 有效成分含量稳定性

6.6.2.1 有效期应≥1年。

6.6.2.2 在有效期内，有效成分含量下降率应≤10%;有效成分无法测定的，其清洗效果应达到要求。

6.6.2.3 含酶医用清洗剂，在有效期内，酶活力下降率应≤20%。

6.6.3 开封后有效期

产品应注明开封后有效期。在标识的开封后有效期内，有效成分含量下降率应≤10%或其清洗效果达到要求。

6.7   清洗效果要求

6.7.1 医用清洗剂应符合下列实验结果:

6.7.2 标明对蛋白有特效的或标明含有蛋白酶的医用清洗剂，对蛋白的去除率应≥90%;标明对淀粉有特效的或标明含有淀粉酶的医用清洗剂，对淀粉的去除率应≥60%;标明对脂肪有特效的或标明含有脂肪酶的医用清洗剂，对脂肪的去除率应≥50%。

6.7.3 标明对生物膜有特效的医用清洗剂，模拟生物膜中的细菌减少值在90%以上，ATP含量减少值在90%以上。

6.7.4 有抗菌作用的医用清洗剂，应说明抗菌作用的原理。在说明书规定的浸泡时间内，医用清洗剂应用液对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率≥90%。

6.8   安全性

6.8.1 医用清洗剂应达到实际无毒级。

6.8.2 医用清洗剂应为对皮肤无刺激或轻度刺激，不引起皮肤变态反应。

6.8.3 医用清洗剂表面活性剂生物降解度应≥90%。

6.9   微生物指标

7   检验方法

7.1 感官: 目测法和鼻嗅法。

7.2 杂质限量: 方法按GB9985。

7.3 金属腐蚀性: 方法见附录A。

7.4 硬度: 方法按GB/T 5750.4。

7.5 稳定性

7.5.1 物理性状稳定性

7.5.2 有效成分含量稳定性

7.5.3 酶活力测试: 方法见附录B。

7.6 清洗效果要求

7.6.1 血液和细菌混合的去除效果试验: 方法见附录C。

7.6.2 人工模拟污染物的去除效果试验: 方法见附录D。

7.6.3 对脂肪、蛋白质和淀粉的去除效果试验: 方法见附录E。

7.6.4 生物膜去除效果试验: 方法见附录F。

7.6.5 细菌杀灭率测试: 方法按《消毒技术规范》(2002版)。

7.7 表面活性剂生物降解度测试方法: 方法按GB/T 15818。

7.8 急性经口毒性试验、皮肤刺激试验、皮肤变态反应试验: 方法按《消毒技术规范》(2002版)。

7.9 菌落总数计数: 方法按《消毒技术规范》(2002版)。

8   运输、贮存和包装

8.1   运输

8.2   贮存

8.2.1 产品应室内保存，并满足产品标识的贮存条件。

8.2.2 堆放要采取必要的防护措施，堆放高度要适当，避免包装损坏。

8.2.3 在本标准规定的运输和储存条件下，在包装完整未经启封时，产品的保质期按销售包装标识执行。

8.3   包装

8.3.1   最小销售包装的要求

8.3.2   运输包装的要求

9   标识要求

9.1   产品说明书

9.2   标志

10   注意事项

10.1   医用清洗剂不得口服，置于儿童不易触及处。

10.2   过敏者慎用。

10.3   医用清洗剂稀释后的应用液应一次性使用。

10.4   如有拮抗物质，说明书应列出，避免合用。

10.5   置于避光、阴凉、干燥处保存。

10.6   开瓶后应拧紧瓶盖，在规定有效期内使用。

A.1   目的

A.2   试验器材

A.2.1   金属片:圆形，直径24.0mm，厚1.0mm，穿一直径为2.0mm小孔，表面积总值约为9.8cm(包括上、下、周边表面与小孔侧面)。光洁度为6。原料如下:

A.2.2   浸泡容器(玻璃制，带盖，容积为800mL~1000mL)。

A.2.3   砂纸(120号粒度水砂纸，GB/T 2481.1)。

A.2.4   称量杯。

A.2.5   天平(感量0.1mg)。

A.3   试验步骤

A.3.1   用氧化镁糊剂涂抹除油后洗净;以120号粒度水砂纸磨去金属片两面和周边表面的氧化层，再用自来水冲净。测量片的直径、厚度、孔径(精确至0.1mm)。用无水丙酮或无水乙醇再次脱脂。置50℃恒温培养箱中干燥1h，待其温度降至室温后称重(每金属片待天平回零后称重三次，精确至0.1mg，取其平均值作为试验前重量。称重时，应戴洁净手套，勿以手直接接触样片。

A.3.2   按医用清洗剂最高使用浓度配制试验用医用清洗剂，用以浸泡试验样片。浸泡时，每一金属片需浸泡在200mL医用清洗剂中。

A.3.3   金属样片用塑料线系以标签，编号和注明日期，悬挂于医用清洗剂中。一次性浸泡72h。易挥性或有效成分不稳定的医用清洗剂，根据情况，酌情定时更换医用清洗剂，直至浸泡72h。

A.3.4   每种金属每次试验放置三片样片。浸泡时，若同种金属每一样片相隔1cm以上，可在同一容器内(含600mL消毒液)进行。

A.3.5   浸泡到规定时间后，取出金属片，先用自来水冲洗，再用毛刷或其他软性器具去除腐蚀产物。如仍有清除不掉的腐蚀产物，可按JB/T7901所介绍的下列方法清除:

a) 铜片:在室温下浸泡于盐酸溶液(500mL 36%~38%盐酸加蒸馏水至1000mL，盐酸比重为1.19)中 1min~3min;

b) 碳钢片:置含锌粉200g/L的氢氧化钠溶液中，煮沸5min~30min:

c) 铝片:浸泡于三氧化铬磷酸溶液(三氧化铬20g，磷酸500mL，加蒸馏水至1000mL。磷酸比重为1.69)中，升温至80℃，持续5min~10min。如还未清除干净，可在室温浸于硝酸(比重1.42)溶液中1min;

d) 不锈钢:浸泡于60℃硝酸溶液(66%~68%硝酸100mL加蒸馏水至1000mL)20min。或浸于70℃柠檬酸铵溶液(柠檬酸铵150g加蒸馏水至1000mL)中10min~60min.

A.3.6   金属样片除去腐蚀产物并清洗后，用粗滤纸吸干水分，置于垫有滤纸的平皿中，放入50℃恒温培养箱，干燥1h，用镊子夹取，待其温度降至室温后分别在天平上称重。天平回零后称三次，以其平均值作为试验后重量。称重时，与试验前相同，应戴洁净手套，勿以手直接接触样片。

A.3.7   样片在用化学法去除腐蚀物时，需设相应空白对照以校正误差。空白对照样片与实验组样片同样进行表面处理、洗净和称重，但不经医用清洗剂浸泡。同实验组样片用相同方法进行化学处理、水冲洗、干燥、称重，并计算其平均失重值。

A.3.8   试验的全过程应设铜片、碳钢片、铝片和不锈钢片浸泡蒸馏水的对照，不锈钢片浸泡前后的重量差应<0.3mg。否则，在找出原因后，全部试验重做。

A.3.9   试验结果，观察与纪录金属片颜色变化，并以金属腐蚀速率(R)平均值表达，在计算时应减去空白对照组样片的失重值。计算见式(A.1):

A.4   结果判定

A.5   注意事项

A.5.1   每张砂纸只能磨一种金属材料。一个容器盛的医用清洗剂只能浸泡同一种金属。

A.5.2   称重关系到结果的准确性，应认真进行，接触样片的器具不得带有油垢。

A.5.3   所用金属片大小、厚薄应严格一致，表面需磨光。

A.5.4   试验期间，需换医用清洗剂溶液时，操作应迅速，勿使样片暴露空气中过久。

A.5.5   金属样片仅可使用一次，否则影响试验的准确性。

A.5.6   试验在20℃~25℃条件下进行。

A.5.7   在报告其结果时，应对试验后金属样片的外观变化等现象进行描述。

10.6   开瓶后应拧紧瓶盖，在规定有效期内使用。

B.1   a-淀粉酶

B.1.1   定义

B.1.2   原理

B.1.3   试验器材

B.1.3.1 原碘液:称取碘(I2)1lg、碘化钾(KI)22g，用少量蒸馏水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮存于棕色瓶中。

B.1.3.2 稀碘液:吸取原碘液(B.1.3.1)2.00mL，加碘化钾20g用蒸馏水溶解并定容至500mL,贮于棕色瓶中。

B.1.3.3 20g/L可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉2.000g,精确至0.001g，用蒸馏水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后以30mL蒸馏水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。

B.1.3.4 磷酸缓冲液(pH=6.0):称取磷酸氢二钠(Na₂HP0₄·12H₂0)45.23g、柠檬酸(C₆H₈O₇●H₂O) 8.07g,用水溶解并定容至1000mL。配好后用pH计校正。

B.1.3.5 分光光度计:应符合GB/T 9721的有关规定。

B.1.3.6 恒温水浴:60℃±0.2℃。

B.1.3.7 秒表。

B.1.3.8 试管:25mmX200mm。

B.1.4   试验步骤

B.1.4.1 待测酶液的制备

B.1.4.2 测定

B.1.4.2.1吸取可溶性淀粉溶液(B.1.3.3)20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于60℃±0.2℃恒沮水浴中预热5min。

B.1.4.2.2 加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻计时，摇匀，准确反应5min。

B.1.4.2.3 立即吸取反应液(B.1.4.2.2)1.00mL于5.00mL稀碘液(B.1.3.2)中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度(A)。根据其吸光度查表B.1，求得测试酶液的浓度(c)。

B.1.5   计算

B.1.6   结果的允许差

B.2   蛋白酶

B.2.1   范围及目的

B.2.2   试验原理

B.2.3   仪器设备

B.2.4   试验材料

B.2.4.1 Alcalase标准酶(1.61AU/g-Novozyme)或者其他标准酶。

B.2.4.2 偶氮酪蛋白(磺胺一偶氮酪蛋白)。

B.2.4.3 Trizma培养基(三羟甲基氨基甲烷)。

B.2.4.4 蒸馏水。

B.2.4.5 尿素。

B.2.4.6 三氯乙酸。

B.2.5   预配溶液

B.2.5.1 将24.2gTrizma培养基溶解于800mL蒸馏水中，用1mol/L硫酸将pH调节至8.5。转移到1L容量瓶中，用蒸馏水调节至刻度。25℃保存。

B.2.5.2 50%尿素溶液将50g尿素溶解于100mL蒸馏水中。

B.2.5.3 10%三氯乙酸终止剂称量25g三氯乙酸，转移到250mL容量瓶中，用蒸馏水调节至刻度。

B.2.5.4 0.6%偶氮酪蛋白底物溶液称量0.6g偶氮酪蛋白，加入10mL50%的尿素溶液，搅拌至溶解。用Tris缓冲液调节至100mL，继续搅拌，直至无颗粒可见。为降低空白反应影响，应当天配制新鲜的底物溶液。

B.2.6   标准溶液的制备

B.2.6.1 常备标准溶液

B.2.6.2 标准工作溶液(每个浓度平行制备)

B.2.6.2.1 标准溶液1(1.3X10⁻⁵AU/mL):吸取0.05mL常备Alcalase标准溶液至10mL容量瓶中，用Tris缓冲液稀释至刻度。

B.2.6.2.2 标准溶液2(2.6X10⁻⁵AU/mL):吸取0.10mL常备Alcalase标准溶液至10mL容量瓶中，用Tris缓冲液稀释至刻度。

B.2.6.2.3 标准溶液3(5.2X10⁻⁵AU/mL):吸取0.20mL常备Alcalase标准溶液至10mL容量瓶中，用Tris缓冲液稀释至刻度。

B.2.6.2.4 标准溶液4(1.04X10⁻⁴AU/mL):吸取0.40mL常备Alcalase标准溶液至10mL容量瓶中，用Tris缓冲液稀释至刻度。

B.2.6.2.5 标准溶液5(2.08X10⁻⁴AU/mL):吸取0.80mL常备A1calase标准溶液至10mL容量瓶中，用Tris缓冲液稀释至刻度。

B.2.7   样品溶液的制备(平行制样)

B.2.8   试验步骤

B.2.8.1 将水浴设置到40℃。

B.2.8.2 开始分析之前10min内，先将底物溶液置于水浴中加热。

B.2.8.3 分别将每种样品(标准样品和待测样品)吸取1.0mL至20mL试管中。每种样品需要做平行分析。

B.2.8.4 将所有的试管放在40℃水浴中保存约1min，以达到平衡。

B.2.8.5 开始反应:精确控制30s间隔，向每支试管中加入5mL底物溶液、涡流搅拌后再放回到水浴中。将每支试管在水浴中保持30min。

B.2.8.6 终止反应:将5.0mL终止剂按30s的间隔依次加入到每支试管中，涡流搅拌后在室温下放置10min。

B.2.8.7 向标准空白和样品空白中分别加入1.0mLStd 2(5.2X10⁻⁵AU/mL)溶液和样品溶液(可选择稀释后颜色最深的一个样品)。

B.2.8.8 15min~20min内，用滤纸将所有的试管中试剂过滤到清洁干燥的试管中。

B.2.8.9 分光光度计测量标准溶液、样品溶液和空白溶液在390nm处的吸光度，以蒸馏水做参比。

B.2.9   结果计算

B.2.9.1 用空白的吸光度补偿标准样品和待测样品的吸光度(标准样品和待测样品的吸光度减去相应的

空白吸光度)。

B.2.9.2 绘制“标准浓度(AU/mL)vs吸光度”的图形。

B.2.9.3 用excel表格或者科学计算方法参考标准图谱估计样品的浓度(线形回归)。

B.2.9.4 对吸取的样品，蛋白酶活性计算见式(B.2):

B.2.9.5 对称量的样品，蛋白酶活性计算见式(B.3):

B.3   蛋白酶活力测定(福林法)

B.3.1   定义

B.3.2   原理

B.3.3   仪器设备

B.3.4   试验材料

B.3.4.1 福林试剂的制备

B.3.4.2 缓冲液的制备

B.3.4.2.1 乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶

B.3.4.2.2 磷酸缓冲液的制备(pH=7.5) 适用于中性蛋白酶

B.3.4.2.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶

B.3.4.3   0.4mol/L碳酸钠溶液

B.3.4.4   0.4mol/L的三氯醋酸液

B.3.4.5   0.5mol/L的NaOH

B.3.4.6   10.00mg/mL酪素溶液

B.3.4.7   100μg/ml酪氨酸标准溶液

B.3.4.7.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L的盐酸60mL溶解后并用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即为1.00mg/mL的酪氨酸溶液。

B.3.4.7.2 吸取1.00mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL,即得100.0μg/L   L-酪氨酸标准溶液。

B.3.4.8   酶样的制备

B.3.5   标准曲线的绘制

B.3.5.1   L-酪氨酸标准溶液按表B.2配制。

B.3.5.2   分别取上述溶液各1.00mL(需做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL。福林试剂使用溶液1.00mL,置于40±0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。

B.3.6   试验步骤

B.3.6.1   先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水裕中，预热5min。

B.3.6.2   取4支试管，各加入1mL酶液。

B.3.6.3   取一支作为空白管，加2mL三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1mL酪素，摇匀，40℃保温10min。

B.3.6.4   取出试管，3支测试管中各加入2mL三氯乙酸，空白管中加1mL酪素。

B.3.6.5   静置10min，过滤沉淀。

B.3.6.6   各取1mL滤液分别加0.4mol/L的Na:C0,5ml，福林试剂1mL。在40℃显色20min。680nm处测0D值。以空白管调零点。

B.3.7   结果计算

B.3.7.1   将测得的各平行样求OD值的均值。

B.3.7.2   酶的活性单位计算见式(B.4):

B.4   脂肪酶

B.4.1   定义

B.4.2   原理

RCOOH +NaOH ——→ RCOONa+H₂O

B.4.3   试验材料

B.4.3.1   聚乙烯醇(PVA)聚合度1750±50。

B.4.3.2   橄榄油。

B.4.3.3   95%(体积分数)乙醇(GB/T 679)。

B.4.3.4   底物溶液的制备:

B.4.3.5   0.025mol/L磷酸缓冲液(pH=7.5):

B.4.3.6   氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=0.05mol/L:按GB/T 601配制与标定c(Na0H)=0.5mol/L氢氧化钠标准溶液。使用时，准确稀释10倍。

B.4.3.7   10g/L酚酸指示液:按GB/T 603配制。

B.4.4   仪器设备

B.4.4.1 恒温水浴:40℃±0.2℃。

B.4.4.2 高速组织捣碎机: 8000r/min~12000r/min。

B.4.4.3 pH计: 分度值为0.02pH单位或2mV。

B.4.4.4 电磁搅拌器。

B.4.4.5 微量滴定: 10mL，分刻度≤0.05mL。

B.4.5   试验步骤

B.4.5.1   待测酶液的制备

B.4.5.2   测定

B.4.5.2.1   电位滴定法(方法一)

B.4.5.2.1.1 用pH=9.22的硼酸钠(硼砂)缓冲液，按pH计使用说明书进行校正仪器。

B.4.5.2.1.2 取两个100mL烧杯，于第一个空白杯(A)和第二个样品杯(B)中各加底物溶液(B.4.3.4)4.00mL和磷酸缓冲液(B.4.3.5)5.00mL，再于A杯中加入95%乙醇(B.4.3.3)15.0mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B两杯中，各加待侧酶液1.00mL，立即混匀计时，在40℃±0.2℃水浴中准确反应15min，于B杯中立即补加95%乙醇15.0mL终止反应，取出。

B.4.5.2.1.3 在烧杯中放一枚转子，置于电磁搅拌器上，在搅拌下，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至pH=10.3，为其终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。

B.4.5.2.2   指示剂滴定法(方法二)

B.4.5.2.2.1 取两个100mL锥形瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中，各加底物溶液(B.4.3.4)4.00mL和磷酸缓冲液(B.4.3.5)5.00mL，再于A瓶中加入95%乙醇(B.4.3.3)15.0mL，于40℃±0.2℃水浴预热5min，然后，在两瓶中各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，在40℃±0.2℃水浴中准确反应15min，在B瓶中立即补加95%乙醇15.0mL终止反应，取出。

B.4.5.2.2.2 于空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪为其终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。

B.4.6   结果计算

B.4.7   结果的允许差

C.1   目的

C.2   试验材料

C.2.1   菌血悬液

C.2.2   洗脱液

C.2.3   稀释液:胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)

C.2.4   酪蛋白胨-大豆蛋白胨培养基(CSL)

C.2.5   酪蛋白胨一大豆蛋白胨琼脂(CSA)

C.2.6   试验载体

C.2.7   清洗机模拟仪

有金属螺盖的玻璃罐(容积为470mL,可高压灭菌，并可放入转轴的广口罐)，将罐口覆盖牛皮纸，加盖，于121℃压力蒸汽灭菌后备用。转动速度为45r/min~60r/min的滚动摇床。

C.2.8   ATP测试试剂及仪器

C.3   试验步骤

C.3.1   菌血悬液制备

C.3.2   载体制备

C.3.3   配制清洗剂样品

C.3.4   清洗程序

C.3.5   清洗效果评价

C.3.5.1 细菌计数法

C.3.5.2 ATP含量测定

C.4   结果判断

D.1   目的

通过符合ISO 15883标准的模拟污染物的去除效果，判定其清洗效果。

D.2   试验器材

模拟污染物:蛋白、脂类和多糖的混合物。

分析天平感量0.1mg。

有金属螺盖的玻璃罐(容积为470mL,可高压灭菌，并可放入转轴的广口罐)，将罐口覆盖牛皮纸，加盖，于121℃压力蒸汽灭菌后备用。

转动速度为45r/min~60r/min的滚动摇床。

D.3   试验步骤

3片模拟污染物为一组，在干燥器中过夜后，称重为m₀每组污染片待天平回零后称重三次，精确至0.1mg，取其平均值作为试验前重量。称重时，应用镊子夹取，勿以手直接接触样片。

在试验开始前20min,将盛有300mL按产品说明书配制好的待测医用清洗剂的玻璃罐，在水浴中恒温至40℃。

将3片模拟污染物分别放入3个盛有300mL待测医用清洗剂玻璃罐中，加盖。以45r/min~60r/min的转动速度旋转洗涤预定时间，取下玻璃罐，取出模拟污染物，挂在晾架上，30℃存放2h后，称重为m₁，并目测其清洗效果。

称量后的污染片，按以下步骤去污:

a)   含洗涤剂的水中浸泡30min:

b)   超声波中清洗30min;

c)   纯净水洗净;

d)   放入含洗涤剂的水中煮沸30min:

e)   用自来水洗净;

f)   用蒸馏水煮沸10min;

g)   用蒸馏水漂洗至pH呈中性;

h)   挂在晾架上30min后并在干燥器中过夜后，称每组样品的重量，为m₂。

计算人工模拟污染物去除率见式(D.1):

式中:

R——人工模拟污染物去除率，%;

m₀——清洗前模拟污染物质量，单位为毫克(mg);

m₁——医用清洗剂清洗后模拟污染物质量，单位为毫克(mg):

m₂——洗净后模拟污染物质量，单位为毫克(mg);

每一待测样品需准备三组模拟污染物。

D.4   结果判断

目测:肉眼观察污染物完全溶解脱落，外观表面清洁光亮、无残留物质。

人工模拟污染物去除率≥95%，可判定为对模拟污染物的清洗效果合格。

E.1   目的

医用清洗剂对测定污染物的去除率。

E.2   试验器材

E.2.1   模拟污染物

猪油 (食品级)。

牛血清白蛋白 (纯度≥90%)。

淀粉 (纯度≥90%)。

墙纸糊。

E.2.2   载体片

聚四氟乙烯片   大小为10cmX5cm、每片重量为1.200g±0.010g。

E.2.3   天平

分析天平   感量0.1mg。

E.2.4   超声波清洗器

E.2.5   恒温水浴箱

E.2.6   清洗机模拟仪

有金属螺盖的玻璃罐(容积为470mL,可高压灭菌，并可放入转轴的广口罐)，将罐口覆盖牛皮纸，加盖，于121℃压力蒸汽灭菌后备用。

转动速度为45r/min~60r/min的滚动摇床。

E.2.7   人工模拟污染物配方

淀粉污染物:   淀粉3g、墙纸糊0.5g，加水至100mL;

蛋白质污染物:   牛血清白蛋白3g、墙纸糊0.5g加水至100mL，配制时，温度不宜超过50℃;

脂肪污染物:   猪油，使用时，置电炉上加热，45℃油温染片。

E.3   试验步骤

聚四氟乙烯片在使用前，应先进行脱脂处理。脱脂方法如下:

a)   放在含洗涤剂的水中煮沸30min;

b)   以自来水洗净;

c)   用蒸馏水煮沸10min;

d)   用蒸馏水漂洗至pH呈中性;

e)   晾干。

将聚四氟乙烯片上沿画出10mm线，下沿画出5mm线，污染物限制在此范围内。

将洁净的聚四氟乙烯片在干燥器放置过夜，每三片为一组，用分析天平精确称重(准确至1mg)为m₀，待天平回零后称重三次，精确至0.1mg，取其平均值作为试验前重量。称重时，应用镊子夹取，勿以手直接接触样片。

污染片制备方法:

a)淀粉污染片或蛋白质污染片的制备手持夹子将聚四氟乙烯片放入淀粉污染物或蛋白质污染物中至10mm 上沿线1s~2s，缓缓取出，挂回原来晾片架上，依次制备污片;

b)脂肪污染片的制备取20μL猪油滴染于聚四氟乙烯片，在标定的区域内涂匀。

每组污片上污物总量应为30mg±5mg。在干燥器中放置2h后，称重为m₁。

在试验开始前20min，将盛有300mL按产品说明书配制好的待测医用清洗剂的玻璃罐，在水浴中恒温至产品说明书所规定的温度。

将三片污染片分别放入三个盛有300mL医用清洗剂的玻璃罐中，加盖。以45r/min~60r/min的转动速度旋转洗涤预定时间，取下玻璃罐，取出聚四氟乙烯片，挂在晾片架上，放置于干燥器中，2h后称重

为m。每一待测样品需准备三组污染片。

计算人工模拟污染物去除率见式(E.1):

E.4   结果判定

对蛋白质的去除率应≥90%;对淀粉的去除率应≥60%;对脂肪的去除率应≥50%，可判定为对蛋白质、淀粉和脂肪的清洗效果合格。

F.1   目的

内镜用医用清洗剂对人工培养聚四氟乙烯管腔中生物膜的去除效果。

F.2   试验器材

F.2.1   菌株

铜绿假单胞菌   ATCC 15442。

F.2.2   洗脱液

吐温-80   0.1%。

蛋白胨     1.0%。

氯化钠     0.85%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.2.3   稀释液:胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)

胰蛋白胨   1.0%。

氯化钠      0.85%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.2.4   胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)

胰蛋白胨    1.5%。

大豆蛋白胨   0.5%。

氯化钠       0.5%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.2.5   胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)

胰蛋白胨    1.5%。

大豆蛋白胨   0.5%。

氯化钠       0.5%。

琼脂          1.6%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.2.6   ATP测试试剂及仪器

ATP裂解液。

ATP荧光素酶。

ATP标准品。

ATP生物荧光测定仪。

F.2.7   载体管腔

聚四氟乙烯连接管(外径10mm~12mm，内径6mm，长度1000mm)经脱脂处理，压力蒸汽灭菌后备用。

聚四氟乙烯载体管(外径6mm，内径2mm，长度1000mm)经脱脂处理，压力蒸汽灭菌后备用。

F.2.8   蠕动泵

F.2.9   电热恒温水浴

F.3   试验步骤

F.3.1   菌悬液制备

将分离纯化后铜绿假单胞菌接种到TSA斜面，培养24h。用TSB洗菌，并用TSB将菌液调整至所需浓度。取配制好的菌悬液2mL,加入到含200mLTSB的锥形瓶中,使其菌液浓度为10CFU/mL备用。

F.3.2   生物膜培养模型搭建

用带有通气孔(过滤层0.22mm)的塞子将烧瓶塞住，通过通气孔延伸到瓶底，另一个软管在TSB液面上。通过蠕动泵和软管子将内径2mm的聚四氟乙烯管相连接组成管道系统，保持在37℃的条件，用蠕动泵在10mL/min的流量下循环，4h/d。每日更换TSB,连续培养5d。第6d用500mL无菌生理盐水以10mL/min的流速冲洗管腔去除管腔内壁的浮游菌(连接见图F.1)。

F.3.3   清洗程序

在试验开始前20min，将盛有400mL按产品说明书配制好的待测医用清洗剂的锥形瓶，在水浴中恒温至40℃(或为产品说明书所规定温度的最低值)备用。

内径6mm的聚四氟乙烯管经过灭菌后，在50mm、500mm和950mm处剪开，备用。将冲洗完毕的生物膜管腔截取为5cm的小段，作为污染物样本。分别连接在模拟内镜体的50mm、500mm和950mm处。对连接好的模拟内镜体分别用恒温至40℃的400mL的清洗液以100mL/min的流速循环清洗5min后，再以10mL/min的流速用无菌蒸馏水冲洗1min，以冲洗管腔内残留的清洗剂。

F.3.4   清洗效果评价

清洗完毕后，用灭菌镊子将含生物膜的样本取出,将样本纵向分为两部分后,放入含10mL洗脱液(或中和剂)的试管中，在40KHz的超声波中清洗6.5min后，进行细菌计数和ATP含量测定:

a)   细菌计数用稀释液对洗脱液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，分别吸取1.0mL接种平皿，每份样本接种两个平皿;

b)   ATP 含量测定吸取洗脱液50μL，加入50μL裂解液，震荡混合，作用30s后加入400μL荧光素酶，进行RLU测定，然后加入10μL标准品溶液，读取其RLU及ATP 含量。

同时用400mL的无菌蒸馏水代替医用清洗机对连接好的模拟内镜体按F.3.3进行清洗后,分别进行细菌计数、ATP生物荧光和蛋白测定。

阳性对照组取两个样本，置室温，不作任何处理，待试验组处理至最长作用时间，将样本按F.3.3方法洗脱后，分别进行细菌计数、ATP生物荧光和蛋白测定，作为阳性对照。

阴性对照组取脱脂灭菌后，未经任何处理的内径为2mm、5cm长的聚四氟乙烯管，分别进行细菌计数法、ATP生物荧光法测定，作为阴性对照。

试验重复三次。

F.4   结果判定

生物膜制备合格判定标准:细菌计数应达1X10⁷CFU/样本~1X10⁸CFU/样本;水冲洗5min时，细菌减少应≤50%，ATP含量减少应≤50%。阴性对照应无菌生长。

医用清洗剂清洗合格标准:三次试验细菌减少值在90%以上，ATP含量减少值在90%以上，可判为对生物膜去除效果合格。

生物膜去除效果测定方法二(平整表面培养法)

F.5   目的

医用清洗剂对人工培养在聚碳酸酯载体表面的生物膜的去除效果。

F.6   试验材料

F.6.1   菌株

铜绿假单胞菌   ATCC 15442。

F.6.2   洗脱液

生理盐水   (0.85%的氯化钠溶液)。

F.6.3   稀释液:胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)

胰蛋白胨   1.0%。

氯化钠     0.85%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.6.4   胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)

胰蛋白胨    1.5%。

大豆蛋白胨   0.5%。

氯化钠       0.5%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.6.5   胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)

胰蛋白胨    1.5%。

大豆蛋白胨   0.5%。

氯化钠       0.5%。

琼脂          1.6%。

用蒸馏水配制而成，调节pH值在7.0±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

F.6.6   ATP测试试剂及仪器

ATP裂解液。

ATP荧光素酶。

ATP标准品。

ATP生物荧光测定仪。

F.6.7   载体

聚碳酸酯小圆片，直径1cm，厚度0.3cm。

F.6.8   Masterflex蠕动泵

F.6.9   DK-450B电热恒温水浴

F.6.10   KQ-110E超声波清洗器

F.7   试验步骤

F.7.1   菌悬液制备

挑取24h新鲜斜面的3~5个典型单个菌落，接种于100mLTSB中，于35℃±2℃条件下，振荡培养20h~24h，使菌液浓度达到10⁸cfu/mL，备用。

F.7.2   生物膜培养模型搭建

选取聚碳酸酯小圆片,用超声波清洗后用去离子水清洗，仔细安装在反应杆上。向主反应器中加入500mL浓度为300mg/L的TSB溶液中，完成安装反应器，置于121℃灭菌20min后冷却备用。向主反应器中无菌加入1mL菌悬液后，打开磁力搅拌器，大约125r/min,温度20℃±2℃培养24h。培养24h后，用无菌导管连接储液罐、蠕动泵和废液缸，储液罐中为100mg/L的TSB溶液。打开蠕动泵，流速控制在11.7±0.2mL/min，流动培养24h(连接见图F.2)。

F.7.3   清洗程序

在无菌条件下，取出培养好的有生物膜生长的载体片，用蒸馏水反复冲洗载体片表面浮游菌，然后将其放入含10mL清洗剂应用液的试管中，于40℃±2℃水浴中放置30min。

F.7.4   清洗效果评价

清洗程序完毕后，用灭菌镊子将载体片取出，放入含5mL0.85%氯化钠溶液的试管中，在40KHz的超声波中清洗15min后，进行细菌计数和ATP含量测定。细菌计数和ATP含量测定方法见F.3.4。

F.8   结果判定

生物膜制备合格判定标准:   细菌计数应达1X10⁷CFU/样本~1X10⁸CFU/样本。

医用清洗剂清洗合格标准:   三次试验细菌减少值在90%以上，ATP含量减少值在90%以上，可判为对生物膜去除效果合格。